آزمایش سمیت ژنی – HAPPI

سمیت ژنی به عنوان اصلاح اطلاعات ژنتیکی در یک سلول زنده تعریف می شود. این پتانسیل یک ترکیب یا مخلوط را برای آسیب رساندن به اطلاعات ژنتیکی سلولی و در نتیجه احتمال ایجاد جهش هایی که منجر به سرطان می شوند ، ایجاد می کند. این می تواند بر DNA ، ماده ژنتیکی سلول تأثیر مستقیم یا غیرمستقیم بگذارد. سلولهای در معرض یک محیط ژنوتوکسیک ممکن است به روشهای مختلف عمل کنند. اگر محیط سمی پایدار و تجمعی باشد ، سلول ممکن است تصمیم بگیرد با تغییر بیان ژن های خود “تنظیم” کند. از آنجا که بسیاری از محصولات مراقبت از پوست برای استفاده طولانی مدت و گاهی اوقات در مناطق وسیع از بدن در نظر گرفته شده اند ، قرار گرفتن در معرض مداوم تجمعی مورد توجه قرار گرفته است.

یک سلول سالم طبیعی سعی در جلوگیری از بیان جهش ژنوتوکسیک یا با ترمیم DNA آنزیمی یا با ترویج مرگ برنامه ریزی شده سلول سلولی به نام آپوپتوز دارد. آپوپتوز سلول را از بین می برد بنابراین بافت عملکردی سالم حفظ می شود. اگر آسیب اصلاح نشود ، ممکن است منجر به جهش زایی شود. همانطور که اشاره شد ، تغییر ماده ژنتیکی می تواند تأثیرات مستقیم یا غیرمستقیمی بر روی DNA داشته باشد. به عنوان مثال ، القا of جهش ، فعال شدن رویداد اشتباه و آسیب مستقیم DNA منجر به جهش می شود. از آنجا که سطح پوست ، لایه شاخی از مواد غیر زنده (قرنیه و لیپیدها) تشکیل شده است ، و از آنجا که سمیت ژنی فقط برای سلولهای زنده قابل استفاده است ، در صورت نفوذ این ترکیب به ژنوتوکسیک ، یک ترکیب موضعی اعمال می شود. مانع خارجی و قادر است با لایه های زنده پوست ارتباط برقرار کند و یا اثر را به لایه های زنده منتقل کند. بنابراین ، ممکن است جالب باشد که یک مطالعه جذب پوست انجام دهید (همانطور که در ستون مارس 2015 من شرح داده شده است).

سمیت ژنی را نباید با جهش زایی اشتباه گرفت. ترکیباتی که جهش زا هستند ژنوتوکسیک هستند زیرا تغییرات ژنتیکی ایجاد می کنند. با این حال ، همه ترکیبات ژنوتوکسیک جهش زا نیستند. یعنی یک ترکیب می تواند اطلاعات ژنتیکی را تغییر دهد اما جهش ایجاد نکند.

تجزیه و تحلیل سمیت ژنی بالقوه در تعیین ارتباط از روش به عنوان بخشی از یک رویکرد ردیف در ارزیابی ایمنی از اهمیت اساسی برخوردار است. اگر روش اثر پیشنهادی ترکیب مربوط به تغییر در ژنهای سلولی یا پروتئین ها باشد ، آزمایش سمیت ژنی ممکن است در مجموعه مطالعات قبلی گنجانده شود و برای حذف چنین مسمومیت احتمالی ، باید یک بسته مطالعه جامع تری تهیه شود. به عنوان مثال ، ترکیباتی که با ادعای “ترمیم DNA” ، “کاهش مرگ سلولی” یا “افزایش زنده ماندن سلول” آزمایش و به بازار عرضه شده اند ، باید با دقت بیشتر برای این نقطه پایانی ایمنی مورد مطالعه قرار گیرند. تغییر در ژنوم در سطوح مختلف می تواند یک روند طولانی باشد و معمولاً نتیجه قرار گرفتن در معرض مدت زمان کوتاه نیست. همانطور که گفته شد ، از آنجا که محصولات آرایشی و بهداشتی به طور منظم ماهها و حتی سالها روی پوست قرار می گیرند ، باید از نظر سمیت ژنی آزمایش شوند. اثر ژنوتوکسیک می تواند به عنوان عضوی در معرض پوست باشد. و اگر از طریق پوست به گردش خون نفوذ کند – به اندام های داخلی نیز.

علاوه بر این ، پوست و سایر اندام ها حاوی مکانیسم های متابولیکی شناخته شده به عنوان سیتوکروم P-450 هستند. شدیدترین P-450 در بدن در کبد ، ارگان اصلی متابولیک وجود دارد. با این حال ، پوست حاوی آنزیم های متابولیکی نیز هست. این یک کاست از پروتئین های هماهنگ شده ، در درجه اول مرتبط با غشا است که مواد شیمیایی درون زا و برون زا را با هدف نهایی متابولیزه می کند تا خنثی سازی و دفع از بدن را امکان پذیر کند. در حالی که ترکیب آزمایش شده ممکن است اثر ژنوتوکسیک از خود نشان ندهد ، متابولیت های آن ممکن است – بنابراین یک آزمایش سمیت ژنی معتبر باید شامل ارزیابی اثرات متابولیت های بالقوه باشد.

ستونی در مورد متابولیسم پوست در اواخر سال جاری منتشر می شود.

سنجش های متعدد می توانند تعیین کنند که آیا یک ماده شیمیایی پتانسیل ایجاد آسیب ژنتیکی را دارد یا خیر. فقط تعداد کمی در اینجا گنجانده خواهد شد. سنجش ها در مدل استفاده شده ، میانگین و زمان قرار گرفتن در معرض ، نقاط پایانی آزمایش شده و مفاهیم ترجمه شده متفاوت است.

نقاط نهایی ایجاد شده می تواند شامل موارد زیر باشد:

  • جهش های تک ژنی.

  • جهش های Multilocus ، که شامل تغییرات ساختاری در کروموزوم ها مانند شکستگی ، حذف و بازآرایی یا تغییرات عددی در ژنوم است. تغییرات عددی ژنوم می تواند آنئوپلوئیدی (وجود یک یا چند کروموزوم بالاتر یا کمتر از تعداد طبیعی) و پلی پلوئیدی (تأثیر روی یک یا چند مجموعه اضافی از کروموزوم ها) باشد.

  • تغییرات DNA تعیین ترکیبات اضافی DNA یا شکستگی رشته DNA ، یا اندازه گیری سنتز DNA برنامه ریزی نشده به عنوان یک پاسخ سلولی به آسیب DNA.

از آنجا که آزمایش in vitro برای سمیت ژنی می تواند حساس باشد ، ضروری است که قبل از آزمایش ، ترکیب کاملاً و گسترده مشخص شود. در صورت مصنوعی ، این ترکیب باید از نظر سطح و ماهیت ناخالصی ها مورد بررسی قرار گیرد. اگر سطح ناخالصی نسبتاً بالایی وجود داشته باشد ، این احتمال وجود دارد که ناخالصی ها علت نتیجه مثبت باشند و نه ترکیب واقعی علاقه. اگر ترکیب آزمایش شده منشأ طبیعی داشته باشد (مانند عصاره گیاه یا بذر) و قوام گروه به گروه تغییرات عمده ای را نشان می دهد ، ترکیب باید حداقل برای سه قسمت مختلف که تنوع ترکیب آن را نشان می دهد ، آزمایش شود.

روش به کار رفته و مورد تایید برای ارزیابی سمیت ژنی ، روش Ames است که جهش زایی را در یک آزمایش جهش ژن معکوس باکتری تشخیص می دهد. نشان داده شده است که این آزمایش تغییرات ژنتیکی مربوطه و اکثر جوندگان سموم و مواد سرطان زای انسان را تشخیص می دهد. اگر آزمایش Ames انجام شود ، مطالعه دوم در ردیف باید احتمال خطر سلولهای پستانداران را ارزیابی کند. تست ایمز در اوایل دهه 1970 توسط بروس ایمز در دانشگاه برکلی کالیفرنیا شرح داده شد. این ماده برای تشخیص جهش های بالقوه در باکتری ها طراحی شده و به عنوان روشی سریع ، نسبتاً ارزان و مناسب برای ارزیابی پتانسیل جهش زایی یک ترکیب عمل می کند. این آزمایش با جوجه کشی باکتری جهش یافته با ترکیب مورد نظر ، با یا بدون یک سیستم متابولیک برون زا انجام می شود. سیستم متابولیک ، به طور کلی یک هموژن کبد موش صحرایی (اصطلاح “کسر S9”) ، برای ارزیابی اثر ژنوتوکسیک احتمالی متابولیت ها در سیستم اضافه می شود. همانطور که قبلا توضیح داده شد ، متابولیت ها ترکیباتی هستند که در نتیجه تبدیل آنزیمی در فرهنگ ایجاد می شوند. آنها به طور بالقوه می توانند بی اثر باشند. فعالیتی شبیه به بستر (که ترکیب آزمایش شده است) یا سمی انجام دهد. پنج غلظت یا بیشتر ماده معمولاً آزمایش می شود و شامل کنترل های منفی (وسیله نقلیه) و مثبت با و بدون فعال سازی متابولیک است. باکتریهای جهش یافته ، که توانایی تولید هیستیدین را دارند ، در محیط عاری از هیستیدین کلنی ایجاد می کنند.

اصل اصلی آزمایش Ames استفاده از سویه های وابسته به اسید آمینه Salmonella typhimurium و Escherichia coli است. هر کدام جهشهای مختلفی را در ژنهای مختلف در اپرون هیستیدین حمل می کنند. این بدان معنی است که آنها نمی توانند هیستیدین تولید کنند و در محیط کمبود هیستیدین رشد نمی کنند مگر اینکه جهش پیدا کنند. این جهش ها به عنوان هسته هایی برای جهش زاها عمل می کنند که از طریق مکانیسم های مختلف باعث آسیب DNA می شوند. در صورت عدم وجود منبع هیستیدین خارجی ، باکتری ها نمی توانند رشد کرده و مستعمرات تشکیل دهند. بنابراین تنها باکتری هایی که برای بازگشت به استقلال هیستیدین جهش یافته اند ، مستعمرات تشکیل می دهند. تعداد کلنی های برگرداننده خود به خود در هر صفحه نسبتاً ثابت است. وقتی جهش زایی به صفحه اضافه می شود ، تعداد کلنی های برگشتی در هر صفحه ، معمولاً به روشی وابسته به دوز ، افزایش می یابد. از آزمایش Ames نمی توان در مواردی که ماده مورد آزمایش برای باکتری ها مانند آنتی بیوتیک ها یا مواد نگهدارنده سمی است استفاده کرد. در چنین شرایطی توصیه می شود که یک ردیف از دو آزمایش در سلولهای پستانداران انجام شود. علاوه بر این واقعیت که در این روش از پروکاریوت ها استفاده می شود ، به این معنی است که ممکن است نشان دهنده رفتار سلول های انسانی نباشد. برای شناسایی جهش های مثبت کاذب آزمایشات دیگری لازم است. به عنوان مثال ، مواد حاوی نیترات انتخاب شده (مانند نیتروگلیسیرین) می توانند با تولید اکسید نیتریک نتایج مثبت کاذب ایجاد کنند. اما همه مواد سرطان زا (مثلاً آزبست) جهش زا نیستند. در نتیجه ، روش Ames ممکن است برخی مواد سرطان زا را شناسایی نکند.

سنجش های ایمز معمولاً در دو طبقه انجام می شوند. سنجش اولیه شامل پنج سویه سالمونلا تیفی موریوم و یک سویه اشریشیا کلی است. هشت تا ده سطح دوز ، و همچنین کنترل کننده های وسایل نقلیه ، جهش های مثبت و سیستم های فعال سازی متابولیک S9 ممکن است آزمایش شوند. کشت سه برابر در هر سویه یا دوز برای هر دو سیستم آزمایش انجام می شود تا تولید آماری امکان پذیر شود. ردیف دوم در این روش به عنوان یک ردیف تصدیقی تلقی می شود. در اینجا ، همین پنج سویه برای حداقل پنج سطح دوز که به عنوان تعیین شده در روش اولیه و همچنین فعال سازی متابولیکی تنظیم شده است ، آزمایش می شوند. محققانی که محدودیت های آزمایش Ames را برجسته می کنند ، به این واقعیت اشاره می کنند که این باکتری از باکتری های بسیار متفاوت با سلول های انسانی استفاده می کند و بنابراین از مدل هایی استفاده می کند که از سلول های انسانی یا پستانداران استفاده می کنند.

یکی از سیستم های آزمایشگاهی آزمایشگاهی سلول پستانداران برای آزمایش جهش زایی ، روش ریز هسته است. در این روش وجود تکه های کروموزومی که بعنوان اضافات گرد کوچک به هسته ظاهر می شوند (بنابراین اصطلاحاً “ریز هسته” نامیده می شود) در گلبول های قرمز پس از قرار گرفتن در معرض ماده آزمایش تعیین می شود. گلبول های قرمز بالغ به طور معمول هسته های خود را در طول رشد دفع می کنند و بنابراین حاوی DNA نیستند. اگر قطعات کروموزومی هنگام تقسیم سلول تشکیل شود ، ممکن است در سلول حفظ شود و به عنوان معیاری برای آسیب کروموزومی در نظر گرفته شود. روش میکرو هسته ای در شرایط in vitro توسط ECVAM مورد تأیید گذشته نگر قرار گرفته است و در نشریه ای از سال 2008 به تفصیل شرح داده شده است. تیم مدیریت ECVAM نتیجه گرفتند که آزمایش میکرو هسته ای آزمایشگاهی قابل اعتماد و مرتبط است و می تواند به عنوان گزینه ای برای آزمایش انحراف کروموزوم آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد. .

این آزمایش انحرافات ساختاری کروموزومی و همچنین انحرافات عددی را تشخیص می دهد (هم پلی پلوئیدی و هم آنوپلوئیدی ؛ به توضیحات قبلی مراجعه کنید). اصلاح اخیر آزمایش میکرو هسته ای در شرایط in vitro ، استفاده از مدل های پوست سه بعدی بازسازی شده انسان برای ارزیابی سمیت ژنی مواد مصنوعی است. به عنوان نمونه ای از این مدل ، EpiDerm در ستون تحریک پوستی که قبلاً منتشر شده شرح داده شده است (به ستون من در سپتامبر 2015 مراجعه کنید).

به طور خلاصه ، این پروتکل از دوزهای موضعی مختلف ماده آزمایش در معرض 48 تا 72 ساعت با قرار گرفتن در معرض تکرار هر 24 ساعت در حضور 3 میکروگرم در میلی لیتر سیتوکلازین-B در محیط استفاده می کند. سلولها از بافت 24 ساعت پس از آخرین دوز به شرح زیر برداشت می شوند:

  • بافت ها با DPBS (نمک بافر فسفات Dulbecco) شسته می شوند ، و پس از آن قرار گرفتن در معرض EDTA ، و سپس در معرض تریپسین-EDTA قرار می گیرند.

  • بافتها از غشا separated جدا شده و دوباره در معرض تریپسین-EDTA قرار می گیرند.

  • محلول خنثی کننده تریپسین-EDTA قبل از سانتریفیوژ به سوسپانسیون سلول اضافه می شود.

  • پس از سانتریفیوژ ، محلول KCl به آرامی به سلول ها و به دنبال آن 3 میلی لیتر سرما اضافه می شود.

  • MeOH / اسید استیک (3: 1) ؛

  • سوسپانسیون سلول دوباره سانتریفیوژ می شود ، محیط برداشته می شود.

  • 4 میلی لیتر MeOH / اسید استیک اضافه می شود. سوسپانسیون سلول دوباره سانتریفیوژ شده و محیط برداشته می شود.

  • سلولها بلافاصله روی لام قرار می گیرند. و

  • اسلایدها در محلول آکریدین نارنجی (AO) رنگ آمیزی می شوند ، شستشو می شوند و سپس با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت نمره گذاری می شوند.

به طور خلاصه ، سمیت ژنی یک نقطه پایانی ایمنی لازم و مرتبط در سطح ارزیابی ترکیبات موضعی و فرمولاسیون است زیرا ممکن است تغییرات در ژنوم سلول پس از قرار گرفتن در معرض تجمع مداوم به مواد شیمیایی رخ دهد. از آنجا که فرمولاسیون های آرایشی برای مدت زمان طولانی مورد استفاده قرار می گیرند ، بنابراین ارزیابی مهم است. برای تعیین دامنه و اولویت سمیت ژنی در سطوح مطالعات ارزیابی ایمنی ، توصیه می شود در ارزیابی سیلیکون مانند روابط ساختار و فعالیت انجام شود. نحوه اثربخشی پیشنهاد شده و در صورت وجود داده های قبلی را مرور کنید. ملاحظات کلیدی اضافی وزن مولکولی و لیپوفیلیسیت برای نفوذ بالقوه پوست است. پروتکل های مختلف سمیت ژنی در حال حاضر برای انجام آزمایشگاه در دسترس هستند و کاربرد آنها باید مورد به مورد بررسی شود. بیش از یک آزمایش باید انجام شود و به دلیل محدودیت های آزمایش Ames ، نباید یک مطالعه مستقل در سطح باشد.

ارجاع
Mutagenesis vol. 23 نه 4 ص 271–283 ، 2008 doi: 10.1093 / mutage / gen010
نشریه Advance Access 7 مارس 2008 اعتبار سنجی گذشته نگر ECVAM میکرو هسته در شرایط آزمایشگاهی


نوا دایان

مالک
دکتر ناوا دایان LLC

Nava Dayan Ph.D. صاحب دکتر ناوا دایان LLC ، یک مشاوره علوم و تحقیقات پوست و ارائه خدمات به صنایع دارویی ، آرایشی و بهداشتی و مراقبت های شخصی است. او 25 سال تجربه در بخش مراقبت از پوست ، و بیش از 150 اعتبار انتشار دارد.
تلفن: 201-206-7341
ایمیل: [email protected]

Leave a reply

You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>